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Cette étude concerne des vins rouges et rosés essentiellement du millésime 2018, soutirés après fermentation malolactique. Ces vins ont été prélevés avant et après traitement dans des domaines et des caves coopératives situés dans le Sud Drôme - Nord Vaucluse. Les volumes des cuves considérées vont de 150 à 6500 hectolitres.

1) Choix de la méthode d’analyse

Les techniques d’analyses microbiologiques ainsi que les connaissances sur les micro-organismes ont grandement évolué ces dernières années.

Il est désormais connu que toute population de micro-organismes est composée de trois sous-populations dont l’état physiologique est différent. Au sein d’une population on distingue ainsi des cellules mortes, des cellules vivantes et des Cellules Viables non Cultivables (VNC). Si les états morts ou vivants sont simples à comprendre, l’état VNC mérite d’être expliqué. Il s’agit d’une réponse du micro-organisme à un stress. Le SO₂, par exemple est un facteur de stress. Ce stress va induire une baisse de vitalité chez le micro-organisme, empêchant sa croissance sur les milieux de culture en boite de Petri. Ce stress peut être tel qu’il va aboutir à la mort de micro-organisme mais dans certains cas, une fois le facteur stressant disparu, le micro-organisme peut revenir à un état physiologique vivant et retrouver l’intégralité de son potentiel de croissance.

La connaissance de ces différents états a permis le développement de nouvelles techniques d’analyse aptes à détecter et dénombrer les micro-organismes selon leur état physiologique mais a également permis de mieux connaître les forces et faiblesses des techniques actuelles (Tableau 1).

Tableau 1 : Comparaison des techniques de numération des micro-organismes en fonction de leur état physiologique.

Il est donc nécessaire de disposer d’une technique rapide, pour plus de réactivité, et permettant l’évaluation juste et précise du risque, en prenant en compte les micro-organismes en états vivant et VNC. Les cellules mortes ne présentent plus de risque pour le vin. Les deux techniques appropriées sont donc les numérations par épifluorescence et par vPCR. La vPCR est une technique qui a déjà été présentée dans l’article suivant : Brettanomyces : déterminer le risque réel par une nouvelle méthode d’analyse fiable, rapide et efficace, la vPCR. 

La vPCR n’ayant pour l’instant été développée que pour le suivi des populations de Brettanomyces, notre choix s‘est porté sur la technique d’épifluorescence, capable de détecter les populations de levures et bactéries, sans distinction de genre/espèce. La boîte de Petri, technique la plus largement répandue à l’heure actuelle, ne permet pas une totale évaluation du risque puisque ne dénombrant pas les cellules en état VNC. Ainsi l’épifluorescence dénombre en moyenne 800 fois plus de levures et 400 fois plus de bactéries que la boîte de Petri.

L’épifluorescence consiste à additionner une molécule fluorescente à un échantillon de vin. Cette molécule ne va rentrer que dans les cellules viables (vivantes ou VNC). Les micro-organismes devenus fluorescents sont alors comptables avec un microscope adapté (Figure 1).

Figure 1 : Photographie de micro-organismes marqués en épifluorescence.

2) Efficacité microbiologique comparée des techniques de clarification

Les résultats de cette étude sont présentés sous forme de facteurs de réduction. Cette valeur est établie en comparant les populations avant et après traitement. Concrètement, un facteur de réduction de 10 signifie une division par 10 des populations, un facteur de réduction de 10000 signifie une division par 10000, etc.

2.1) Micro-filtration tangentielle

La technique de micro-filtration tangentielle a mis du temps à s’implanter dans le milieu du vin, mais elle est désormais largement répandue et reconnue pour son efficacité. Une vingtaine de comparaisons ont été réalisées sur des vins filtrés en caves coopératives et par prestation au domaine. Les filtres employés sont des filtres organiques et céramiques. Pour une meilleure compréhension, les résultats sont présentés sans distinction du type de filtre, car d’après nos essais, cela n’influe pas sur l’efficacité de filtration.

Tableau 2 : Facteurs de réduction microbienne par micro-filtration tangentielle

L’amplitude des valeurs est très importante, autant sur les populations de levures que de bactéries. Dans certains la population est très peu réduite, avec une division des populations par 6 à 8, alors que dans d’autres cas l’efficacité est très importante avec une division des populations par 40000 à 60000.

Ces amplitudes sont parfois relevées au sein d’une même cave, indiquant alors une efficacité différente selon la cuve filtrée. Les réductions supérieures à 40000 ont été relevées autant sur des vins filtrés sur membrane céramique que sur membrane organique. Le type de filtre n’est donc pas une explication des différences mesurées. Plusieurs paramètres en revanche sont à prendre en compte : la charge microbiologique initiale peut avoir une influence sur l’efficacité de filtration, mais surtout, une hygiène insuffisante en sortie de filtration peut provoquer des recontaminations.

Ces résultats montrent que l’analyse apporte beaucoup de renseignements sur la charge microbiologique effective. Souvent pratiquée à l’aveugle, c’est-à-dire sans analyse microbiologique à l’appui, la micro-filtration tangentielle peut parfois s’avérer insuffisante pour réduire de façon significative les populations de micro-organismes. Par exemple, si la charge microbiologique est supérieure à 100000 levures ou bactéries/mL, il restera tout de même une faible population après filtration. En connaissant précisément la charge microbiologique avant et/ou après filtration par analyse, il est possible de savoir si la réduction de population est suffisante ou s’il est nécessaire de procéder à une seconde filtration.

2.2) Centrifugation

Cette technique est plutôt réservée aux caves coopératives qui sont souvent équipés de centrifugeuses. 15 vins ont ici été analysés et comparés.

Là encore, de grandes disparités existent selon les caves et les cuves. La technique peut être très efficace sur les levures, avec une division des populations par plus de 100000, mais le sera beaucoup moins sur les bactéries (Tableau 3).

Tableau 3 : Facteurs de réduction microbienne par centrifugation

La centrifugation est souvent utilisée en clarification précoce et cet objectif est parfaitement atteignable au vu des résultats obtenus. L’impact sur les bactéries reste faible du fait du principe de la technique : étant basée sur la gravité, seules les levures, environ 10 fois plus grosses que les bactéries sont correctement éliminées.

2.3) Filtration sur plaque

Nos essais nous ont permis de comparer 4 porosités différentes pour une dizaine de vins filtrés. Il est intéressant de comparer les résultats en fonction de la porosité des plaques (Figure 2).

Figure 2 : Facteurs de réduction microbienne en fonction de la porosité.

Comme attendu, l’efficacité de filtration décroît lorsque la taille des pores augmente. Quelques nuances peuvent toutefois être apportées. Dans cet essai, l’élimination des levures s’est avérée aussi efficace à 0,65 µm qu’à 3,6 µm. Les facteurs de réduction chutent drastiquement à 4µm. Concernant les bactéries, on a presque une décroissance linéaire en fonction de la taille des pores. Mais nous avons mesuré une meilleure réduction à 1,2 µm qu’à 0,65 µm. Ce résultat vient illustrer que l’efficacité de la filtration plaque ne peut se résumer à une simple taille de pores. La conduite de la filtration a également un impact très fort. Le fait de limiter la pression permet d’optimiser l’efficacité de filtration : cela explique qu’il est possible d’atteindre de très bons facteurs de réduction des bactéries à 1,2 µm. L’inconvénient est que la filtration sera parfois beaucoup plus lente, cela étant lié à la faible pression.

2.4) Collage

Trois gélatines différentes ont été employées pour une vingtaine de comparaisons différentes. L’efficacité est variable sur les levures (Tableau 4), mais dans tous les cas, nous n’avons pas noté de réduction notable des populations bactériennes. Deux des gélatines divisent les populations de levures par des valeurs proches de 1000. Une telle réduction constitue une aide précieuse pour atteindre un vin pauvre en micro-organismes et ainsi maximiser l’efficacité d’une filtration avant mise.

Tableau 4 : Facteurs de réduction microbienne par collage à la gélatine

Conclusion

LACO s’est donné les moyens pour proposer des méthodes d’analyse au plus juste du risque réel. L’épifluorescence permet ainsi de quantifier en 24H les levures et bactéries vivantes ou en état VNC. Cette technique est donc particulièrement adaptée à la quantification de la charge microbienne après toute technique de clarification, et ce, particulièrement avant mise en bouteilles. Embouteiller des micro-organismes pouvant avoir des conséquences fâcheuses, connaître les populations avant mise et/ou après filtration est une information précieuse et très complémentaire des résultats d’analyses œnologiques. Par exemple, en cas de population microbienne élevée avant mise, une étape supplémentaire de filtration permettra d’éviter l’apparition de troubles ou dépôts en bouteilles.

Les différentes techniques de clarification ont des efficacités différentes. La micro-filtration tangentielle peut donner d’excellents résultats en terme de réduction des populations microbiennes, mais l’hygiène en sortie de filtration est capitale. Cette remarque est d’ailleurs vraie quelle que soit le type de méthode de clarification. La centrifugation est surtout efficace sur les populations de levures, réservant cette technique aux vins en sortie de vinification. La filtration sur plaque peut être d’une grande efficacité. Le choix de la porosité est déterminant, tout autant que la conduite de la filtration. Enfin le collage peut se montrer un excellent moyen pour réduire les populations, même si dans notre essai, ce sont surtout les populations de levures qui sont impactées.

Enfin, cet essai met en évidence la complémentarité de ces différentes techniques de clarification. Si certaines comme la centrifugation sont réservées à un usage particulier, d’autres comme la micro-filtration tangentielle ou la filtration sur plaques peuvent être très polyvalentes sous réserve de bien connaître leur potentiel et leur limite. Il faut ainsi être strict sur les conditions d’hygiène après filtration pour bénéficier de sa pleine efficacité en évitant les recontaminations après filtration. Et une filtration plaque à 4 µm ne sera que dégrossissante et ne pourra atteindre la même efficacité qu’une filtration à 0,65 µm ou 1,2 µm.

Laurent MASSINI

Microbiologiste

E mail : l.massini@laco-laboratoire.com

Brettanomyces, diagnostiquée pour la première fois dans la vallée du Rhône au début des années 2000, pose toujours d’importants problèmes, occasionnant souvent des coûts de traitement importants pour s’en débarrasser. Il est donc nécessaire de disposer de résultats les plus fiables possibles, pour éviter tout sur-traitement et ainsi limiter les coûts.

Dans la presse spécialisée, se sont succédés ces dernières années de nombreux articles dénigrant les méthodes actuelles de quantification de Brettanomyces, mettant en avant leurs faiblesses. Ainsi, la qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction), largement utilisée depuis 2005, s’est vue reprocher de doser aussi les cellules mortes. La culture sur boîte de Petri (7 jours) ne permet pas de quantifier les cellules en état VNC (viable non cultivable). Dans ce contexte, des méthodes telles que la cytométrie en flux ont émergé. Très mise en avant depuis quelques années, cette technique, bien que très séduisante car rapide, n’est pas le meilleur outil pour quantifier Brettanomyces. Cette technique n’est pas spécifique : il s’agit d’une quantification précise, mais sans distinction de genre ou espèce. Cette technique a été décrite comme spécifique, or, il s’agit d’un simple postulat de départ : il est considéré que si le prélèvement est réalisé en élevage, il ne reste à ce stade que les Brettanomyces. Malheureusement, si souvent les Brettanomyces sont majoritaires à ce stade, les Saccharomyces sont loin d’avoir disparu, avec une forte variabilité selon les domaines. Des kits sont ensuite apparus sur le marché pour rendre spécifique cette analyse par cytométrie. Le principe était prometteur, mais les résultats ont montré les grandes limites de la méthode.

Fort de ce constat, en tant que laboratoire au service des vignerons de la région, il nous fallait disposer d’une méthode rapide, la plus objective possible et surtout, au plus proche du risque réel. Il a été décidé de s’appuyer sur les forces (rapidité, spécificité, répétabilité) de notre méthode actuelle par qPCR et de la faire évoluer. En effet, la qPCR mesure l’ADN, donc les cellules mortes peuvent réagir (cf Le Vigneron des Côtes du Rhône N°874 : Brettanomyces : bien choisir son analyse pour évaluer le risque). Il est souvent considéré que les mortes dénombrées dans ce cas, sont les mortes récentes (depuis quelques semaines). LACO s’est orienté vers la vPCR (Viability Polymerase Chain Reaction) qui est une évolution de la qPCR. Cette technique consiste en un prétraitement d’échantillon, qui va bloquer l’ADN des cellules mortes, qui ne pourra tout simplement plus réagir par PCR. Ne sont alors détectées que les cellules vivantes ou en état VNC. Cette technique de blocage d’ADN existe depuis les années 2000, mais n’avait pas encore trouvé sa place en œnologie.

Des essais ont été menés au LACO pour valider cette technique en comparant trois modalités : la qPCR, la vPCR et la boîte de Petri, en tant que technique de référence. La qPCR donne systématiquement des résultats plus élevés, en moyenne 40% plus élevés que la boîte et 32% que la vPCR.

Les résultats peuvent être classés en trois catégories :

• En vert, Les résultats positifs en vPCR mais négatifs par culture sur boîte de Petri : il s’agit dans ce cas des cellules en état VNC. Elles n’ont pas les ressources suffisantes pour croître sur boîte, mais gardent toujours une certaine viabilité, détectée par la méthode vPCR.
• En jaune, les résultats positifs par vPCR et par culture, mais dont les valeurs sont systématiquement plus élevées par vPCR que par culture sur boîte de Petri. Il s’agit de populations mixtes, comportant à la fois des cellules viables, donc détectées aussi bien par culture que par vPCR et des cellules VNC détectées uniquement par vPCR.
• En bleu, les résultats positifs et comparables par culture et par vPCR. Les populations dans ce cas sont viables et ne comportent pas de VNC : la vPCR et la culture donnent des résultats similaires, comme l’attestent la pente et le coefficient de corrélation. Dans le cas présent, il existe une bonne corrélation entre ces deux techniques attestant que la vPCR ne mesure bien que les Brettanomyces vivantes, ainsi que les VNC.

Au LACO, nous disposons donc dorénavant avec la vPCR d’une méthode rapide (analyse en 24H) et fiable, qui permet de détecter autant les cellules viables de Brettanomyces, que les cellules en état VNC. Les cellules mortes ne sont pas prises en compte.

Une application possible est le suivi physiologique des populations de Brettanomyces après un sulfitage. Le SO₂ va induire un stress important, voire une mortalité de Brettanomyces.

A partir d’un échantillon de vin fortement contaminé par Brettanomyces, deux niveaux de sulfitage sont appliqués : 0,35 mg/L de SO₂ actif (environ 18 mg/L de SO₂ libre), considéré comme une couverture minimale et 0,8 mg/L de SO₂ actif (environ 40 mg/L de SO₂ libre), considéré comme la couverture maximale. Les deux vins sont analysés selon les trois méthodes : vPCR, qPCR et numération sur boîte de Petri.

On remarquera que les valeurs par qPCR sont stables, attestant que cette méthode surestime le résultat en dosant les cellules mortes, durant 50 jours dans le cadre de notre essai. Les valeurs de cellules viables et cultivables (numération en UFC/mL) sont faibles et sous-estiment le risque réel du fait du stress lié au sulfitage et donc du passage en VNC d’un grand nombre de cellules. Les valeurs données par la méthode vPCR représentent les populations viables et VNC. Le résultat est logiquement intermédiaire par rapport à la qPCR et la numération.

Cet essai de sulfitage montre que la couverture en SO₂ permet de réguler des populations de Brettanomyces. 0,35 mg/L de SO₂ actif sont insuffisants pour assurer une protection : en quinze jours, les populations remontent à un niveau problématique. 0,8 mg/L de SO₂ actif assurent une bonne protection, mais de nombreuses Brettanomyces VNC restent présents. Le SO₂ à dose suffisante est donc un moyen efficace pour contenir Brettanomyces.

En conclusion, la vPCR est réellement une méthode innovante. Rapide (24H), elle permet une juste évaluation du risque Brettanomyces, en écartant les mortes pour ne doser que les vivantes et VNC. LACO met d’ores et déjà cette méthode à disposition des professionnels soucieux de maîtriser ce risque en toute objectivité. Nous prévoyons maintenant de faire également évoluer nos méthodes actuelles de qPCR levures et bactéries vers la vPCR.

Le sixième prélèvement de maturité a été effectué les 17 et 18 septembre 2018. Découvrez nos conclusions en parcourant les liens suivants :

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Le cinquième prélèvement de maturité a été effectué du 10 au 11 septembre 2018. Découvrez nos conclusions en parcourant les liens suivants :

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Le quatrième prélèvement de maturité a été effectué du 03 au 04 septembre 2018. Découvrez nos conclusions en parcourant les liens suivants :

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