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ROSISSEMENT OXYDATIF DES VINS BLANCS_PINKING

I.                  Le rosissement oxydatif des vins blancs, généralités

A.                Le pinking, … c’est quoi ?

Le pinking ou « rosissement oxydatif » est un défaut du vin blanc lié à l’évolution de la couleur vers le gris-rose. Une oxydation ménagée provoquée lors de mouvements de vins (pompage, filtration, stabilisation au froid ou mise en bouteille) est la cause principale du rosissement de vins blancs sensibles. On sait par ailleurs qu’un vin froid (température < 13°C) dissout plus volontiers l’oxygène. Une mauvaise maitrise de l’oxygène associée à une température de manipulation faible provoquera donc plus facilement cette déviation si le vin est sensible. Les maturités poussées et les faibles rendements augmentent la quantité de polyphénols des raisins et des vins.

Les observations montrent que les vins jeunes vinifiés et élevés en conditions réductrices sont souvent les plus sensibles.

On sait que les composés formés ne sont ni sensibles au SO2 ni sensibles à la variation de pH. Ils sont par contre sensibles à l’exposition à la lumière : le Traité d’œnologie Tome 1 précise ainsi que la couleur rosée disparait naturellement après quelques semaines. Les Procyanidines du vin, en présence d’oxygène se transforment en Anthocyanidols légèrement colorés. En phase réductrice, ces Procyanidines se dégradent lentement pour donner des Flavènes incolores. Malheureusement, ce défaut peut s’accompagner d’une évolution prématurée du vin et d’une perte aromatique.

B.                Tester le risque de rosissement de mon vin blanc, c’est possible

Il existe une méthode qui permet d’évaluer précocement le risque de rosissement d’un vin blanc. Ce test donnant un « Indice de rosissement » peut se faire dès la fermentation et permet ainsi d’envisager des collages précoces qui dénatureront moins le vin à venir. Ce test se réalise aussi sur les vins finis. Il consiste à mesurer la différence de densité optique à 500nm avant et 24  heures après ajout d’eau oxygénée à l’échantillon. Le résultat est exprimé en Indice de Rosissement (IR).

La mesure de l’« Indice de rosissement » donne :

A0 l’absorbance obtenue à 500 nm dans le vin sans ajout d’eau oxygénée et An celle obtenue à 500 nm dans le vin traité à l’eau oxygénée.

 

IR = (AnA0) *100

 

Le risque de rosissement existe si cet indice est supérieur à 5. Ainsi, plus le Δ DO500 est élevé plus le risque de rosissement est grand. Il est alors impératif de traiter le moût ou le vin.

Ce test, réalisé précocement sur les vins ou cépages habituellement sensibles permet de connaitre la fragilité du futur vin vis-à-vis de ce phénomène.

II.                  Mon vin blanc présente un IR élevé, que dois-je faire ?

A.                En vinification sur moût

Certains cépages sont plus sensibles à ce phénomène (Sauvignon, Viognier, Muscat, etc) et il convient de les traiter en connaissance de causes. LACO vous propose  une mesure de l’Indice de rosissement (IR) précoce qui permettra de gérer ce problème très tôt dans l’itinéraire technique. Votre œnologue en collaboration avec le vinificateur pourront alors décider d’opérations à mettre en place pour diminuer ce risque et/ou protéger le vin.

L’entrée des raisins blancs doit se faire en limitant au maximum les oxydations et macérations. Il est donc nécessaire d’être vigilants, de maitriser la température et de limiter les triturations des raisins.

Concernant le pressurage, le fractionnement des jus en fonction de leur charge en polyphénols permet d’en limiter la présence ou du moins de séparer les moûts les plus chargés. La mesure de la conductivité permet une séparation de ces jus puisqu’elle est corrélée à la charge en polyphénols.

Une autre technique consiste à utiliser le phénomène d’hyper oxydation qui vise à apporter de l’oxygène en saturation dans le moût et ainsi éliminer de façon très précoce la fraction de polyphénols sensibles à l’oxydation.

La littérature et les sites spécialisés préconisent l’utilisation précoce de fortes doses de PVPP (autour de 100 g/hl) associée à l’emploie de bentonite. Ces traitements peuvent permettre de diminuer le risque de « rosissement oxydatif », mais restent controversés et des essais en laboratoire sont le meilleur moyen de tester leur efficacité.  

Le phénomène de « rosissement oxydatif » fait donc intervenir les polyphénols présents dans les moûts et vins blancs. Ainsi, en vinification, dès les premières phases de traitement des raisins, l’objectif est de diminuer le potentiel d’oxydabilité des jus et donc de protéger, séparer et traiter les moûts sensibles.

La mesure de l’IR précoce et l’expérience de chaque vinificateur permet de connaitre la sensibilité de chaque moût. Le traitement dès les phases de fermentation permet d’éliminer plus efficacement les éléments sources de ce rosissement et de ne pas faire subir au seul vin fini, les traitements indispensables à la stabilité du produit final. La PVPP aux doses maximales, les protéines de pois, les charbons et les caséines sont des « outils » qui nous permettent très tôt de commencer à traiter le problème. LACO réalise des essais de collage permettant d’adapter les traitements au plus juste (nature du traitement et  la quantité adapté à chaque cépage en fonction de l’IR mesuré).

B.                En élevage

Il est reconnu que l’élevage sur lies diminue la sensibilité des vins blancs au « rosissement oxydatif ».  L’élevage sur lies totales en barriques permet de diminuer l’indice de polyphénols totaux et de ce fait limite la proportion de polyphénols oxydables responsables de ce rosissement.

La sensibilité d’un vin au rosissement n’évolue pas lors d’un élevage sur lies fines. L’effet des lies totales est donc un élément majeur du traitement des vins dont l’indice de rosissement est élevé.

Les traitements classiques PVPP, protéines de pois, bentonite, etc., sont toujours possible mais leur impact aromatique sera certainement plus important avec une efficacité relative.

C.                Sur vin fini avant la mise

Le collage à la caséine présente très peu d’effet sur la baisse de l’Imais peut s’avérer efficace pour éliminer les  polyphénols. Selon ce que l’on peut lire sur le site du Vinnopôle, « une étude espagnole (Lamuela-Raventos et al. 2001) a montré que des doses élevées de PVPP (100 g/hl) permettaient de réduire la sensibilité des vins blancs au pinking de 74% ». Nous remarquons en pratique qu’au-delà de la difficulté de traiter un vin à cette dose, les effets d’un tel collage ne sont pas systématiques et doivent de plus être effectués très tôt et donc plutôt en vinification pour voir de bons résultats. La PVPP est de plus interdite pour les vinifications de vins Bio (CE n°203-2012). A ce propos, le traité d’œnologie indique que le traitement à la PVPP « ne s’avère pas capable de diminuer significativement la sensibilité au rosissement » (Traité d’œnologie Tome 1). Reste, pour traiter un vin fini, l’ajout d’acide Ascorbique à 45 mg/l qui semble le seul traitement préventif efficace. Il est évident que l’ajout d’acide ascorbique associé à une sensibilité du vin au « rosissement oxydatif » nécessite des précautions toutes particulières vis-à-vis de l’oxygène et de l’emploi du SO2. Le vin traité devra donc être protégé de l’oxygène et sulfité à 25 mg/l de SO2 libre minimum suivant le vin. La mise devra être parfaitement contrôlée avec une dissolution d’oxygène minimale. LACO réalise des audits oxygènes qui permettent d’évaluer l’oxygène apporté lors d’une mise.

III.               Conclusion

Le « rosissement oxydatif » de vins blanc appelé aussi Pinking est un problème de plus en plus rencontré. Le réchauffement climatique et la sensibilité de certains cépages souvent poussés dans leur maturité nous oblige à traiter de nombreux vins.

 

LACO, à travers son expertise et son expérience permet aux vinificateurs d’apprécier le risque qu’encours le moût ou le vin face à ce problème en mesurant l’IR. Cette mesure associée à l’historique des parcelles permet d’adapter très tôt l’itinéraire technique. En effet, peu de solutions sont possibles pour traiter le problème de manière curative, une fois la couleur rosée apparue.

 

LACO met à profit son expérience, ses moyens techniques et scientifiques pour accompagner les vinificateurs dont certains vins blancs présentent cette altération.

                                                                                   Antoine Douziech

                                                                                   Œnologue

                                                                                   Port : 06 24 00 26 13

                                                                                   Email : a.douziech@laco-laboratoire.com

Présentation du millésime 2018

La méthode de sélection des échantillons est constante d’une année à l’autre :

Les critères sont les suivants :

  • Vins rouges du millésime en fin de vinifications
  • Echantillons analysés entre début novembre et début décembre
  • Glucose-fructose < 4.5 g/L
  • Acide L malique < 0.5 g/L

Une seule des analyses des cuves analysées plusieurs fois pendant ce laps de temps est si possible conservée.

Un test de Grubbs est utilisé pour éliminer les valeurs aberrantes, paramètre par paramètre. Le nombre total d’échantillons pris en compte est compris entre 1300 et 2700 suivant les années.

TITRE ALCOOMETRIQUE VOLUMIQUE ACQUIS 

Le millésime 2018 est comparable au millésime 2017 pour ce paramètre :

  • faible proportion (10%) de vins présentant un degré inférieur à 13% contre 35% en 2014, 13% en 2015, 20% en 2016.
  • forte de proportion (plus de 50%) de vins présentant un degré supérieur à 14%, contre 19% en 2014, 41% en 2015, 29% en 2016.
  • plus de 10 % des vins ont un degré supérieur à 15 %, contre 2% en 2014, 7% en 2015 et 4% en 2016.

 ACIDITE VOLATILE 

De même que pour le Titre Alcoométrique Volumique, la répartition des vins en fonction de leur acidité volatile est proche de celle du millésime 2017. Moins de 20% des vins ont une acidité volatile supérieure à 0.50 contre 25% à 30% les années précédentes.

ACIDITE TOTALE 

Pour ce paramètre en revanche les choses sont différentes, le millésime 2018 se rapproche plus du millésime 2015, plus de 30% des vins ont une acidité totale inférieure à 3 g H2SO4/L, contre 17 % en 2017, 8% en 2014, 14% en 2016 et 16% en 2017. A contrario 3% des vins seulement ont une acidité totale supérieure à 3.7 g H2SO4/L contre 25% en 2014, 19% en 2016 et 7% en 2017.

pH

Le pH est une caractéristique de ce millésime : 61% des vins ont un pH supérieur à 3.70, contre 22% en 2014, 47% en 2015, 23% en 2016 et 43% en 2017. Cette tendance était visible dès les premiers contrôles de maturité, mais la différence avec le millésime 2017 était moins marquée à ce stade.

INTENSITE COLORANTE

Contrairement à ce que l’on aurait pu attendre au vu des degrés, les intensités colorantes sont un peu moins élevées qu’en 2017, 61% des vins ont une intensité colorante supérieure à 7.0, contre 41% en 2014, 62% en 2015, 70% en 2016 et 77% en 2017.

DO 280

La proportion de vins présentant une DO280 supérieure à 45 est de 90% c’est-à-dire qu’elle est comparable à celle rencontrée en 2017 (95%), 2016 (91%) et 2015 (93%) contre 56% seulement en 2014. On notera toutefois que la proportion de vins présentant une teneur en polyphénols supérieure à 60 est de 33% ce qui est inférieur à celles rencontrées en 2015 (48%), 2016 (44%) et 2017 (39%), contre 11% en 2014.

CONCLUSIONS

Ces résultats confirment que malgré des degrés élevés prouvant une bonne maturité pulpaire lors de la récolte, le potentiel qualitatif du vignoble ne s’est pas exprimé autant qu’en 2015 ou 2017, certainement à cause des dégâts causés par le mildiou et la sécheresse.

La majorité des vins ont des pH élevés demandant des mesures rigoureuses de conservation, concernant notamment, l’hygiène du matériel et la surveillance des S02 actifs

Ce millésime reste toutefois un millésime de qualité avec des intensités colorantes et une teneur en polyphénols élevées.

Christine Daverede

Responsable Qualité

E mail: c.daverede@laco-laboratoire.com

Préparation des vins à la mise en bouteilles

« Le piège » est d’oublier de tenir des délais, que nécessite chaque opération et ainsi de précipiter la préparation du vin.

Le calendrier des opérations démarre 8 semaines avant le conditionnement. Vous trouverez ci-dessous un exemple de planning dans la première partie de l’article ; la sélection de certains mots clefs en caractères gras est détaillée dans la deuxième partie de l’article.

   

    

Martin HALLOPEAU

Œnologue

Port : 06 86 58 05 82

E mail : m.hallopeau@laco-laboratoire.com

 

Impact des techniques de clarification sur la charge microbiologique des vins

Cette étude concerne des vins rouges et rosés essentiellement du millésime 2018, soutirés après fermentation malolactique. Ces vins ont été prélevés avant et après traitement dans des domaines et des caves coopératives situés dans le Sud Drôme - Nord Vaucluse. Les volumes des cuves considérées vont de 150 à 6500 hectolitres.

1) Choix de la méthode d’analyse

Les techniques d’analyses microbiologiques ainsi que les connaissances sur les micro-organismes ont grandement évolué ces dernières années.

Il est désormais connu que toute population de micro-organismes est composée de trois sous-populations dont l’état physiologique est différent. Au sein d’une population on distingue ainsi des cellules mortes, des cellules vivantes et des Cellules Viables non Cultivables (VNC). Si les états morts ou vivants sont simples à comprendre, l’état VNC mérite d’être expliqué. Il s’agit d’une réponse du micro-organisme à un stress. Le SO2, par exemple est un facteur de stress. Ce stress va induire une baisse de vitalité chez le micro-organisme, empêchant sa croissance sur les milieux de culture en boite de Petri. Ce stress peut être tel qu’il va aboutir à la mort de micro-organisme mais dans certains cas, une fois le facteur stressant disparu, le micro-organisme peut revenir à un état physiologique vivant et retrouver l’intégralité de son potentiel de croissance.

La connaissance de ces différents états a permis le développement de nouvelles techniques d’analyse aptes à détecter et dénombrer les micro-organismes selon leur état physiologique mais a également permis de mieux connaître les forces et faiblesses des techniques actuelles (Tableau 1).

Tableau 1 : Comparaison des techniques de numération des micro-organismes en fonction de leur état physiologique.

Tableau 1

Il est donc nécessaire de disposer d’une technique rapide, pour plus de réactivité, et permettant l’évaluation juste et précise du risque, en prenant en compte les micro-organismes en états vivant et VNC. Les cellules mortes ne présentent plus de risque pour le vin. Les deux techniques appropriées sont donc les numérations par épifluorescence et par vPCR. La vPCR est une technique qui a déjà été présentée dans l’article suivant : Brettanomyces : déterminer le risque réel par une nouvelle méthode d’analyse fiable, rapide et efficace, la vPCR

La vPCR n’ayant pour l’instant été développée que pour le suivi des populations de Brettanomyces, notre choix s‘est porté sur la technique d’épifluorescence, capable de détecter les populations de levures et bactéries, sans distinction de genre/espèce. La boîte de Petri, technique la plus largement répandue à l’heure actuelle, ne permet pas une totale évaluation du risque puisque ne dénombrant pas les cellules en état VNC. Ainsi l’épifluorescence dénombre en moyenne 800 fois plus de levures et 400 fois plus de bactéries que la boîte de Petri.

L’épifluorescence consiste à additionner une molécule fluorescente à un échantillon de vin. Cette molécule ne va rentrer que dans les cellules viables (vivantes ou VNC). Les micro-organismes devenus fluorescents sont alors comptables avec un microscope adapté (Figure 1).

Figure 1

Figure 1 : Photographie de micro-organismes marqués en épifluorescence.

2) Efficacité microbiologique comparée des techniques de clarification

Les résultats de cette étude sont présentés sous forme de facteurs de réduction. Cette valeur est établie en comparant les populations avant et après traitement. Concrètement, un facteur de réduction de 10 signifie une division par 10 des populations, un facteur de réduction de 10000 signifie une division par 10000, etc.

2.1) Micro-filtration tangentielle

La technique de micro-filtration tangentielle a mis du temps à s’implanter dans le milieu du vin, mais elle est désormais largement répandue et reconnue pour son efficacité. Une vingtaine de comparaisons ont été réalisées sur des vins filtrés en caves coopératives et par prestation au domaine. Les filtres employés sont des filtres organiques et céramiques. Pour une meilleure compréhension, les résultats sont présentés sans distinction du type de filtre, car d’après nos essais, cela n’influe pas sur l’efficacité de filtration.

Tableau 2 : Facteurs de réduction microbienne par micro-filtration tangentielle

Tableau 2

L’amplitude des valeurs est très importante, autant sur les populations de levures que de bactéries. Dans certains la population est très peu réduite, avec une division des populations par 6 à 8, alors que dans d’autres cas l’efficacité est très importante avec une division des populations par 40000 à 60000.

Ces amplitudes sont parfois relevées au sein d’une même cave, indiquant alors une efficacité différente selon la cuve filtrée. Les réductions supérieures à 40000 ont été relevées autant sur des vins filtrés sur membrane céramique que sur membrane organique. Le type de filtre n’est donc pas une explication des différences mesurées. Plusieurs paramètres en revanche sont à prendre en compte : la charge microbiologique initiale peut avoir une influence sur l’efficacité de filtration, mais surtout, une hygiène insuffisante en sortie de filtration peut provoquer des recontaminations.

Ces résultats montrent que l’analyse apporte beaucoup de renseignements sur la charge microbiologique effective. Souvent pratiquée à l’aveugle, c’est-à-dire sans analyse microbiologique à l’appui, la micro-filtration tangentielle peut parfois s’avérer insuffisante pour réduire de façon significative les populations de micro-organismes. Par exemple, si la charge microbiologique est supérieure à 100000 levures ou bactéries/mL, il restera tout de même une faible population après filtration. En connaissant précisément la charge microbiologique avant et/ou après filtration par analyse, il est possible de savoir si la réduction de population est suffisante ou s’il est nécessaire de procéder à une seconde filtration.

2.2) Centrifugation

Cette technique est plutôt réservée aux caves coopératives qui sont souvent équipés de centrifugeuses. 15 vins ont ici été analysés et comparés.

Là encore, de grandes disparités existent selon les caves et les cuves. La technique peut être très efficace sur les levures, avec une division des populations par plus de 100000, mais le sera beaucoup moins sur les bactéries (Tableau 3).

Tableau 3 : Facteurs de réduction microbienne par centrifugation

Tableau 3

La centrifugation est souvent utilisée en clarification précoce et cet objectif est parfaitement atteignable au vu des résultats obtenus. L’impact sur les bactéries reste faible du fait du principe de la technique : étant basée sur la gravité, seules les levures, environ 10 fois plus grosses que les bactéries sont correctement éliminées.

2.3) Filtration sur plaque

Nos essais nous ont permis de comparer 4 porosités différentes pour une dizaine de vins filtrés. Il est intéressant de comparer les résultats en fonction de la porosité des plaques (Figure 2).

figure 2

Figure 2 : Facteurs de réduction microbienne en fonction de la porosité.

Comme attendu, l’efficacité de filtration décroît lorsque la taille des pores augmente. Quelques nuances peuvent toutefois être apportées. Dans cet essai, l’élimination des levures s’est avérée aussi efficace à 0,65 µm qu’à 3,6 µm. Les facteurs de réduction chutent drastiquement à 4µm. Concernant les bactéries, on a presque une décroissance linéaire en fonction de la taille des pores. Mais nous avons mesuré une meilleure réduction à 1,2 µm qu’à 0,65 µm. Ce résultat vient illustrer que l’efficacité de la filtration plaque ne peut se résumer à une simple taille de pores. La conduite de la filtration a également un impact très fort. Le fait de limiter la pression permet d’optimiser l’efficacité de filtration : cela explique qu’il est possible d’atteindre de très bons facteurs de réduction des bactéries à 1,2 µm. L’inconvénient est que la filtration sera parfois beaucoup plus lente, cela étant lié à la faible pression.

2.4) Collage

Trois gélatines différentes ont été employées pour une vingtaine de comparaisons différentes. L’efficacité est variable sur les levures (Tableau 4), mais dans tous les cas, nous n’avons pas noté de réduction notable des populations bactériennes. Deux des gélatines divisent les populations de levures par des valeurs proches de 1000. Une telle réduction constitue une aide précieuse pour atteindre un vin pauvre en micro-organismes et ainsi maximiser l’efficacité d’une filtration avant mise.

Tableau 4 : Facteurs de réduction microbienne par collage à la gélatine

Tableau 4

Conclusion

LACO s’est donné les moyens pour proposer des méthodes d’analyse au plus juste du risque réel. L’épifluorescence permet ainsi de quantifier en 24H les levures et bactéries vivantes ou en état VNC. Cette technique est donc particulièrement adaptée à la quantification de la charge microbienne après toute technique de clarification, et ce, particulièrement avant mise en bouteilles. Embouteiller des micro-organismes pouvant avoir des conséquences fâcheuses, connaître les populations avant mise et/ou après filtration est une information précieuse et très complémentaire des résultats d’analyses œnologiques. Par exemple, en cas de population microbienne élevée avant mise, une étape supplémentaire de filtration permettra d’éviter l’apparition de troubles ou dépôts en bouteilles.

Les différentes techniques de clarification ont des efficacités différentes. La micro-filtration tangentielle peut donner d’excellents résultats en terme de réduction des populations microbiennes, mais l’hygiène en sortie de filtration est capitale. Cette remarque est d’ailleurs vraie quelle que soit le type de méthode de clarification. La centrifugation est surtout efficace sur les populations de levures, réservant cette technique aux vins en sortie de vinification. La filtration sur plaque peut être d’une grande efficacité. Le choix de la porosité est déterminant, tout autant que la conduite de la filtration. Enfin le collage peut se montrer un excellent moyen pour réduire les populations, même si dans notre essai, ce sont surtout les populations de levures qui sont impactées.

Enfin, cet essai met en évidence la complémentarité de ces différentes techniques de clarification. Si certaines comme la centrifugation sont réservées à un usage particulier, d’autres comme la micro-filtration tangentielle ou la filtration sur plaques peuvent être très polyvalentes sous réserve de bien connaître leur potentiel et leur limite. Il faut ainsi être strict sur les conditions d’hygiène après filtration pour bénéficier de sa pleine efficacité en évitant les recontaminations après filtration. Et une filtration plaque à 4 µm ne sera que dégrossissante et ne pourra atteindre la même efficacité qu’une filtration à 0,65 µm ou 1,2 µm.

Laurent MASSINI

Microbiologiste

E mail : l.massini@laco-laboratoire.com

Etiquette LACO

Brettanomyces : déterminer le risque réel par une nouvelle méthode d’analyse fiable, rapide et efficace, la vPCR

Brettanomyces, diagnostiquée pour la première fois dans la vallée du Rhône au début des années 2000, pose toujours d’importants problèmes, occasionnant souvent des coûts de traitement importants pour s’en débarrasser. Il est donc nécessaire de disposer de résultats les plus fiables possibles, pour éviter tout sur-traitement et ainsi limiter les coûts.

Dans la presse spécialisée, se sont succédés ces dernières années de nombreux articles dénigrant les méthodes actuelles de quantification de Brettanomyces, mettant en avant leurs faiblesses. Ainsi, la qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction), largement utilisée depuis 2005, s’est vue reprocher de doser aussi les cellules mortes. La culture sur boîte de Petri (7 jours) ne permet pas de quantifier les cellules en état VNC (viable non cultivable). Dans ce contexte, des méthodes telles que la cytométrie en flux ont émergé. Très mise en avant depuis quelques années, cette technique, bien que très séduisante car rapide, n’est pas le meilleur outil pour quantifier Brettanomyces. Cette technique n’est pas spécifique : il s’agit d’une quantification précise, mais sans distinction de genre ou espèce. Cette technique a été décrite comme spécifique, or, il s’agit d’un simple postulat de départ : il est considéré que si le prélèvement est réalisé en élevage, il ne reste à ce stade que les Brettanomyces. Malheureusement, si souvent les Brettanomyces sont majoritaires à ce stade, les Saccharomyces sont loin d’avoir disparu, avec une forte variabilité selon les domaines. Des kits sont ensuite apparus sur le marché pour rendre spécifique cette analyse par cytométrie. Le principe était prometteur, mais les résultats ont montré les grandes limites de la méthode.

Fort de ce constat, en tant que laboratoire au service des vignerons de la région, il nous fallait disposer d’une méthode rapide, la plus objective possible et surtout, au plus proche du risque réel. Il a été décidé de s’appuyer sur les forces (rapidité, spécificité, répétabilité) de notre méthode actuelle par qPCR et de la faire évoluer. En effet, la qPCR mesure l’ADN, donc les cellules mortes peuvent réagir (cf Le Vigneron des Côtes du Rhône N°874 : Brettanomyces : bien choisir son analyse pour évaluer le risque). Il est souvent considéré que les mortes dénombrées dans ce cas, sont les mortes récentes (depuis quelques semaines). LACO s’est orienté vers la vPCR (Viability Polymerase Chain Reaction) qui est une évolution de la qPCR. Cette technique consiste en un prétraitement d’échantillon, qui va bloquer l’ADN des cellules mortes, qui ne pourra tout simplement plus réagir par PCR. Ne sont alors détectées que les cellules vivantes ou en état VNC. Cette technique de blocage d’ADN existe depuis les années 2000, mais n’avait pas encore trouvé sa place en œnologie.


Des essais ont été menés au LACO pour valider cette technique en comparant trois modalités : la qPCR, la vPCR et la boîte de Petri, en tant que technique de référence. La qPCR donne systématiquement des résultats plus élevés, en moyenne 40% plus élevés que la boîte et 32% que la vPCR.

Les résultats peuvent être classés en trois catégories :

  • En vert, Les résultats positifs en vPCR mais négatifs par culture sur boîte de Petri : il s’agit dans ce cas des cellules en état VNC. Elles n’ont pas les ressources suffisantes pour croître sur boîte, mais gardent toujours une certaine viabilité, détectée par la méthode vPCR.
  • En jaune, les résultats positifs par vPCR et par culture, mais dont les valeurs sont systématiquement plus élevées par vPCR que par culture sur boîte de Petri. Il s’agit de populations mixtes, comportant à la fois des cellules viables, donc détectées aussi bien par culture que par vPCR et des cellules VNC détectées uniquement par vPCR.
  • En bleu, les résultats positifs et comparables par culture et par vPCR. Les populations dans ce cas sont viables et ne comportent pas de VNC : la vPCR et la culture donnent des résultats similaires, comme l’attestent la pente et le coefficient de corrélation. Dans le cas présent, il existe une bonne corrélation entre ces deux techniques attestant que la vPCR ne mesure bien que les Brettanomyces vivantes, ainsi que les VNC.

Au LACO, nous disposons donc dorénavant avec la vPCR d’une méthode rapide (analyse en 24H) et fiable, qui permet de détecter autant les cellules viables de Brettanomyces, que les cellules en état VNC. Les cellules mortes ne sont pas prises en compte.


Une application possible est le suivi physiologique des populations de Brettanomyces après un sulfitage. Le SO2 va induire un stress important, voire une mortalité de Brettanomyces.

 

A partir d’un échantillon de vin fortement contaminé par Brettanomyces, deux niveaux de sulfitage sont appliqués : 0,35 mg/L de SO2 actif (environ 18 mg/L de SO2 libre), considéré comme une couverture minimale et 0,8 mg/L de SO2 actif (environ 40 mg/L de SO2 libre), considéré comme la couverture maximale. Les deux vins sont analysés selon les trois méthodes : vPCR, qPCR et numération sur boîte de Petri.

On remarquera que les valeurs par qPCR sont stables, attestant que cette méthode surestime le résultat en dosant les cellules mortes, durant 50 jours dans le cadre de notre essai. Les valeurs de cellules viables et cultivables (numération en UFC/mL) sont faibles et sous-estiment le risque réel du fait du stress lié au sulfitage et donc du passage en VNC d’un grand nombre de cellules. Les valeurs données par la méthode vPCR représentent les populations viables et VNC. Le résultat est logiquement intermédiaire par rapport à la qPCR et la numération.

Cet essai de sulfitage montre que la couverture en SO2 permet de réguler des populations de Brettanomyces. 0,35 mg/L de SO2 actif sont insuffisants pour assurer une protection : en quinze jours, les populations remontent à un niveau problématique. 0,8 mg/L de SO2 actif assurent une bonne protection, mais de nombreuses Brettanomyces VNC restent présents. Le SO2 à dose suffisante est donc un moyen efficace pour contenir Brettanomyces.

En conclusion, la vPCR est réellement une méthode innovante. Rapide (24H), elle permet une juste évaluation du risque Brettanomyces, en écartant les mortes pour ne doser que les vivantes et VNC. LACO met d’ores et déjà cette méthode à disposition des professionnels soucieux de maîtriser ce risque en toute objectivité. Nous prévoyons maintenant de faire également évoluer nos méthodes actuelles de qPCR levures et bactéries vers la vPCR.