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Point Maturité - 14/08/2018

La première semaine de suivi de la maturité s'est déroulée du 13 au 17 août 2018. Découvrez nos conclusions en parcourant les liens suivants :

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Les résultats vous sont transmis par email ou fax comme habituellement.

Nous sommes navrés du désagrément et travaillons à rétablir au plus vite la situation.

Le suivi microbiologique des fermentations

Etapes préfermentaires

En vinification conventionnelle, le recours au sulfitage permet de réguler et limiter l’ensemble des micro-organismes du vin qui disposent, dès les premiers stades de la vie du vin, des conditions nécessaires à leur développement : milieu liquide sucré, température favorable. Naturellement, la levure Saccharomyces cerevisiae va finir par s’imposer, du fait de son taux de croissance important, de sa consommation rapide de sucre et de sa production d’alcool. Saccharomyces possède une forte résistance à l’alcool alors que les autres espèces de levures ont une résistance moindre.

Le levurage est une façon de réguler naturellement le milieu. Les levures, ainsi apportées massivement, vont saturer le moût rapidement et limiter la croissance des autres micro-organismes. Encore faut-il que ce levurage soit réalisé dans de bonnes conditions. Le risque d’échec peut être important si la préparation du levain n’est pas optimale. La température et le temps de réhydratation des LSA (Levures Sèches Actives) doivent être conformes aux préconisations du fabricant. Dans le cas contraire, cela se traduit par une mortalité, parfois importante des levures. Or, en période de vendanges, il est fréquent d’oublier un levain en cours de réhydratation, de ne pas avoir le temps de contrôler la température de réhydratation, ou de transférer son levain en cuve quelques heures trop tôt ou trop tard, etc.

Quid des vinifications sans soufre ?

Mais une tendance croissante est le recours à des vinifications sans SO2 et sans levurage. Dans ce cas, il convient d’être vigilant sur la qualité microbiologique du moût. L’absence de SO2 va empêcher ce tri des micro-organismes décrit précédemment. Car même si la diversité de micro-organismes présents peut constituer un apport bénéfique au niveau aromatique, elle comporte également son lot de risques. A ce stade, des levures d’altération, comme Brettanomyces, ou des bactéries lactiques peuvent proliférer et concurrencer Saccharomyces cerevisiae. Le bon déroulement de la fermentation alcoolique va dépendre alors de l’équilibre microbiologique qui s’est instauré dès cette phase préfermentaire.

L’emploi d’un levain est une réponse intéressante en terme de maitrise de la microbiologie du moût. Ce levain, fabriqué avec les raisins du domaine quelques jours avant les vendanges et contrôlé, permettra d’assurer un démarrage rapide des fermentations. Le contrôle du levain consiste à vérifier le bon équilibre microbiologique. Une méthode d’analyse telle que l’épifluorescence permettra de vérifier que les levures possèdent une bonne viabilité et constituent la population majoritaire. Il arrive dans certains cas que les populations de bactéries soient supérieures à celles de levures. Grâce à la détection précoce permise par l’épifluorescence, un tel levain sera écarté pour éviter une fermentation malolactique sous marc. L’absence de levures du genre Brettanomyces peut également être contrôlée par PCR quantitative. Le LACO est en mesure de déterminer les populations de levures du genre Brettanomyces à toutes les étapes, y compris sur moût en pleine fermentation alcoolique. Ces vérifications, qui ne prennent que quelques heures, sont une garantie de ne pas aborder les fermentations avec un gros risque de déviation microbiologique.

Arrêt de Fermentation

En cas de ralentissement voire d’arrêt de fermentation, il convient d’être réactif. Une analyse microbiologique peut se révéler précieuse à ce stade. Il faut recourir à des analyses rapides. Par la technique d’épifluorescence, le LACO détermine, en quelques heures, les populations de levures et de bactéries. Si la population bactérienne est importante, une mise au propre sera nécessaire avant tout ensemencement avec une levure de reprise de fermentation ou un pied de cuve.

Cette étape doit être réalisée avec précaution, en respectant le protocole fourni par votre œnologue. Dans ce cas, comme pour les étapes précédentes, le respect des conditions de température est primordial pour garantir la revivification et l’implantation du levain. Cette température est idéalement de 30°C pour la réhydratation de levures et dans tous les cas (pied de cure ou levures du commerce), il faut éviter tout choc thermique. Un écart de température de 5°C peut être létal dans le cas de micro-organismes comme les levures.

 

Les différentes techniques de suivi microbiologique du LACO

Epifluorescence

Cette méthode est relativement simple, mais requiert l’expérience du microbiologiste pour une numération précise. Elle consiste à réaliser un marquage des micro-organismes viables puis de les compter par observation au microscope. Pour ce marquage, une molécule fluorescente est utilisée, ayant la particularité de pénétrer les cellules par transport actif. Cela signifie que seules les cellules vivantes peuvent être marquées, les mortes ne pouvant pas incorporer la molécule fluorescente.

epifluo

Cette réaction est rapide et prend environ 30 minutes. Les micro-organismes sont ensuite révélés grâce à un microscope à épifluorescence (…). Il suffit alors de les compter. Le microscope ayant été étalonné, le comptage est ramené à l’unité de volume pour fournir une numération par mL.

qPCR

La qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) est une technique basée sur la quantification de l’ADN d’un micro-organisme cible au sein d’un échantillon.

Tous les micro-organismes de l’échantillon sont récupérés par centrifugation. Les cellules vont ensuite être lysées pour libérer leur ADN. Cet ADN sera ensuite purifié pour la réaction d’amplification.

La réaction d’amplification consiste à faire réagir cet ADN avec une amorce, c’est-à-dire une séquence d’ADN spécifique du micro-organisme cible, au moyen d’une enzyme, l’ADN polymérase et de nucléotides, molécules constituantes de l’ADN. Couplé à cette amorce, une molécule fluorescente nommée fluorochrome, dégagera un signal lumineux quantifié en temps réel par l’appareil dans lequel se déroule toute la réaction.

En résumé, plus la quantité d’ADN est importante et plus le signal lumineux est important et rapidement détecté.

Cette technique est d’une grande précision car basée sur l’ADN, spécifique du micro-organisme cible. Cela permet de quantifier les différentes espèces de micro-organismes présents dans un échantillon.

Tout type de micro-organisme peut être quantifié par cette méthode, sous réserve de disposer de la séquence cible. Il est ainsi possible de quantifier toute la microflore du vin : les levures des genres Saccharomyces ou Brettanomyces, les bactéries lactiques des genres Lactobacillus, Pediococcus et Oenococcus, les bactéries acétiques des genres Acetobacter ou Gluconobacter.

Il convient pour chaque analyse de respecter les préconisations de prélèvement pour garantir un résultat représentatif de la contamination.

 

Le point sur Brettanomyces

Brettanomyces, comme l’ensemble des micro-organismes du vin, est présent dès la vigne, en quantités variables selon les parcelles et le millésime. Il représente un vrai risque dès les étapes de fermentation, particulièrement en condition de surmaturité, de macération pré-fermentaire, de température élevée, de SO2 faible à nul. Le cumul de ces paramètres doit inciter à être vigilant car ce micro-organisme produit des phénols volatils, molécules odorantes communiquant au vin des odeurs animales. Le vin perd alors sa dominante fruitée au profit de ces notes désagréables.  Le stade entre les fermentations alcoolique et malolactique est très sensible car le vin, non protégé par le SO2, est exposé à Brettanomyces.

Envisager des contrôles de population réguliers, particulièrement si la FML tarde à démarrer, peut s’avérer judicieux. Ensuite, en élevage, les meilleurs facteurs de protection sont une température faible et un SO2 élevé. Le revêtement des cuves peut également avoir une grande in fluence sur le maintien d’une contamination Brettanomyces dans une cave. Ainsi des cuves cloquées sont un facteur de risque supplémentaire. De la même façon les contenants bois peuvent être vecteurs de contamination : on sait que les micro-organismes peuvent pénétrer jusqu’à presque un centimètre de profondeur dans les douelles.

Le meilleur atout vis-à-vis de Brettanomyces reste donc la prévention.

Brettanomyces ne peut être détecté avec précision par épifluorescence, le marquage étant non spécifique. La seule chose qui le différencierait des autres levures serait sa forme. Or celle-ci est parfois très similaire à celle de Saccharomyces cerevisiae, levure de fermentation.

La technique de choix pour le repérer et le quantifier est dans ce cas la qPCR. C’est la technique la plus « mature » à l’heure actuelle et celle retenue par le LACO. Les autres techniques sur le marché (épifluorescence, cytométrie en flux) sont soit non spécifiques (il est alors considéré que toutes les levures dénombrées sont des Brettanomyces, simplement parce que le prélèvement est réalisé durant l’élevage) soit imprécises (réalisation d’un marquage mais non optimal car pouvant réagir avec d’autres espèces).

La qPCR permettra une numération rapide et précise de Brettanomyces et de statuer sur la contamination. Il est régulièrement pointé du doigt le fait que la qPCR détecte également les cellules mortes. C’est effectivement le cas puisque la détection se base sur l’ADN. Or les cellules mortes contiennent encore leur ADN et la durée avant la lyse cellulaire est encore mal connue. Selon les études réalisées, elle peut varier de quelques semaines à quelques mois.

Fort de ces observations, LACO a décidé d’améliorer sa technique d’analyse par qPCR et travaille à développer une méthode permettant justement d’éliminer les cellules mortes pour apporter une quantification plus proche du risque réel que représente Brettanomyces. Les résultats de ces essais devraient être publiés courant 2018.

 

L’offre globale du LACO

A chaque situation, il existe une analyse microbiologique adaptée.

etapes                  etiquette

L'évolution de l'azote pendant la maturité

I. Notre réseau parcellaire

Les parcelles suivies sont sur deux secteurs : le secteur 5 plus précoce et le secteur 7 plus tardif. Cf. Figure 1.

secteurs

Figure 1 : Localisation des parcelles

La répartition des parcelles par cépage et par secteur est la suivante :

Grenache Syrah Carignan Mourvèdre
Secteur 5 22 11 10 3
Secteur 7 24 17 5 1

Vu le petit nombre de parcelles les résultats du mourvèdre ne sont pas présentés ici.

II. L'azote assimilable et méthode d'analyse

Le rôle de l’azote est détaillé dans l’article sur l’azote fermentaire

Le dosage de l’azote assimilable a été réalisé par IRTF, celui-ci a été calibré par la méthode de dosage dite « formol titration ». L’incertitude de mesure est de 50 mg/l. Dans les résultats présentés ici les différences inférieures à  100 mg/l ne sont pas significatives.

  1. Variations pendant la fin de la maturation et différences entre millésimes :

On constate peu de différences dans les teneurs en azote assimilable au cours des 4 semaines de maturation étudiées (entre le 20 août et le 10 septembre environ). La différence entre les millésimes n’est pas significative, mais on constate cependant que la teneur en azote assimilable des raisins de la récolte 2017, année de sécheresse, a  été plus importante surtout comparée à celle du millésime 2015 (Figure 2).

variations

Figure 2 : Variations de l’azote assimilable du 20 août au 10 septembre par millésime entre 2011 et 2017.

Cette différence est également constatée  sur les moûts à l’encuvage (Figure 3) (données moyennes sur les échantillons analysés au laboratoire)  :

moyennes encuvage

Figure 3 : Teneurs moyennes en azote assimilable dans les raisins et les moûts à l’encuvage de 2011 à 2017.

2. Variations en fonction du cépage et du secteur :

Si on prend les données sur la semaine 36, semaine où le nombre de parcelles analysées est maximal on note peu de différences entre les cépages et les secteurs (Figure 4).

On constate  cependant une tendance répétée d’année en année à une plus faible teneur en azote assimilable dans le cépage carignan sur les deux secteurs et moins systématiquement une plus forte teneur sur la syrah (Figure 4).

moyenne cepage

Figure 4 : Teneurs moyennes en azote assimilable en fonction du cépage, du millésime et du secteur.

3. Azote assimilable total, azote ammoniacal et azote α aminé :

En 2017 nous avons mis en application le dosage par IRTF de l’azote a aminé et de l’azote ammoniacal sur ces parcelles. Figure 5.

Les teneurs ne sont pas significativement différentes d’un secteur à l’autre mais on constate les tendances suivantes :

- la teneur en azote alpha aminé est supérieure à celle de l’azote ammoniacal chez la syrah alors que c’est l’inverse pour le grenache et qu’il y a peu de différence chez le carignan.

- la proportion d’azote a aminé sur les cépages grenache et carignan est plutôt déficitaire (environ 40 à 50%), alors que la syrah présente un profil plus favorable

- la teneur en azote ammoniacal diminue au cours de la maturation, cette diminution est surtout visible à ce stade de la maturité sur le cépage grenache.

moyenne secteur

Figure 5 : Teneurs moyennes en azote assimilable total, azote ammoniacal et azote α aminé entre le 21 août 2017 et le 11 septembre 2017 en fonction du secteur et du cépage.

Ces deux paramètres seront suivis en 2018 et disponibles également sur moûts (comme l’azote assimilable, la méthode IRTF n’est applicable que sur les échantillons ayant moins de 0.2% d’alcool) permettant d’affiner le diagnostic azoté et de mieux raisonner les apports en azote.

Nous avons représenté pour chacun des millésimes de 2013 à 2017, les teneurs en azote assimilable des moûts des cépages rouges et leurs degrés probables (Figure 6). Cette analyse porte sur 5000 échantillons.

Nous constatons, sur le millésime 2015, la pertinence d’un apport azoté pour éviter les arrêts de fermentation, les teneurs en azote des moûts ayant été faibles alors que les degrés probables étaient élevés. Les autres millésimes présentent un profil azoté moyen, favorable au regard de la moyenne des degrés probables observés, notamment 2017.

azote degre

Figure 6 : Teneurs en azote assimilables et degrés probables des moûts de cépage rouges de 2013 à 2017.

Quelle est l’offre LACO ?

Paramètres analysés sur un échantillon de moût, non fermenté :

  • Degré d’alcool probable
  • Acidité totale et pH
  • Azote assimilable total
  • S02 total
  • Potassium

A compter du millésime 2018, LACO vous proposera d’analyser systématiquement l’azote ∝ aminé et l’azote ammoniacal.

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Azote Fermentaire

Le pool azoté du raisin est fixé à la véraison. L’azote contenu dans la pulpe ne représente que 20 à 30 % de l’azote total du raisin !!  La pellicule et les pépins stockent le reste de l’azote

Conséquence : ce qui veut dire qu’en rouge, l’azote disponible est souvent plus important qu’en blanc et rosé, du fait de la macération fermentaire

(cf «  Thiols variétaux – pourquoi de l’azote foliaire « rédigé par le LACO et disponible sur notre site internet : https://www.laco-laboratoire.com/article/thiols-varietaux-pourquoi-de-l-azote-en-pulverisation-foliaire)

raisins

Quelle est la forme d’azote disponible ?

L’azote assimilable par la levure comprend une fraction dite organique constituée d’acides aminés de petits peptides et une fraction dite minérale, sous forme d’azote ammoniacal.

Le ratio souvent retenu est  d’ 1/3  d’azote  minéral et de 2/3 d’azote organique.

Ex :  pour fermenter un 14 degré, le profil azoté théorique serait d’environ 60 mg/l d’azote minéral pour 130 mg/l  d’ azote a aminé.

Mais attention ces valeurs peuvent varier en fonction des conditions fermentaires : Température (< 15°C ou > 30°C), turbidité  NTU < 150, forte exigence nutritionnelle de la levure, …

echantillon             levures

A quoi sert cet azote ?

Il est incontournable au fonctionnement de la levure. Il agit sur la croissance levurienne et la cinétique de fermentation

  • Pendant les 30 à 40 premiers points de densité, l’azote, est nécessaire à la construction des cellules, c’est la phase de croissance des levures
  • Après cette phase, l’azote est toujours nécessaire pour relancer l’activité cellulaire mais surtout utile au fonctionnement enzymatique de la levure

densite

Quel est le meilleur moment d’ajout ?

  • Si un seul apport d’azote est nécessaire, privilégier l’ajout après une baisse de 30 à 40 points de densité (soit 3 - 4 jours de fermentations)

Pourquoi ?  Le milieu est alors très riche en levures mais pauvre en azote.  En effet, les levures ont consommé l’azote initial du mout, pour leur multiplication et les levures ont besoin de nutriments à ce stade pour relancer leur activité de synthèse protéiques

  • En cas de carence azotée trop forte, l’apport d’azote doit être doublé : un premier ajout quand la densité a baissé de 5 à 10 points et un second apport après 3-4 jours de FA
  • L’oxygénation au moment des ajouts de nutriments est impérative, pour la synthèse des facteurs de survie lipidiques

soit 4 minutes d’oxygène /30 hls à 3 bars

cuve

Quelles sont les différentes formes d’azote disponibles pour le vinificateur ?

La première forme  d’azote est sous forme organique à base de levures inertées. La dose limite légale varie avec la composition du produit; se conformer par conséquent,  aux prescriptions du fabriquant. Elle est interdite en Bio.

Ces produits œnologiques sont « des cocktails nutritifs » comprenant ainsi, des sels minéraux, de l’azote minéral, des acides aminés, des peptides complétés par des stérols et des vitamines. Ils contribuent à la synthèse des arômes fermentaires, des rosés et des blancs (réaction de Ehrlich)

Cette forme d’azote est assimilée plus progressivement, elle permet une croissance de la biomasse lente et régulière.

Par conséquent à privilégier au 1/3 tiers de la fermentation  (- 30  à - 40 points de densité) après que l’azote minéral du moût ait été consommé.  Compte tenu du coût, à orienter vers les vins à plus forte valeur ajoutée.  En cas de fortes carences azotées, un premier apport se fera en début de fermentation  (- 5 à - 10 points de densité), 

La seconde forme d’azote minéral est sous forme de phosphate ou de sulfate diammonique. Ces sels d’ammonium peuvent être mélangés à de la thiamine. Cette forme d’azote donne « le coup de fouet » aux levures elles l’assimilent très rapidement.

Par conséquent, à privilégier en cas de très fortes carences azotées. Cet apport minéral a ainsi pour objectif de compléter, la nutrition organique et ce au 1/3 de la fermentation. Seule la forme phosphate est autorisée en Bio. La dose limite légale est fixée à 100 g/hl.

actiferm    vitiamine

Quelle est l’offre LACO ?

Paramètres analysés sur un échantillon de moût, non fermenté :

  • Degré d’alcool probable
  • Acidité totale et pH
  • Azote assimilable total
  • S02 total
  • Potassium

A compter du millésime 2018, LACO vous proposera d’analyser systématiquement l’azote ∝ aminé et l’azote ammoniacal.

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